Bakgrunn
Vår forskningsgruppe har nylig avdekket mekanismer som gjør det mulig for en celle å gjenkjenne skade på membranene i cellen. Vi har også funnet mekanismer for å reparere denne skaden og for å gjenoppbygge membranene som har gått tapt. Videre har vi oppdaget at små proteiner, kjent som ATG8 proteiner, binder seg til de skadde membranene. Men det er fortsatt uklart hva rollen til ATG8-proteinene er ved membranskade, allikevel vet man at feil ved ATG8 aktiviteten gjør oss sårbare for infeksjoner og kan øke risikoen for inflammatoriske sykdommer som systemisk lupus erythematosus (SLE) og Crohns sykdom.
I en annen prosess kalt autofagi, bruker cellene en spesiell membran for å spise opp egne bestanddeler for å gjenvinne disse senere. I denne prosessen fungerer ATG8-proteinene som et forankringspunkt for andre proteiner som ikke kan binde seg direkte til membranen selv. Ved å identifisere disse proteinene som binder seg til ATG8-proteinene i autofagi, har man fått en mekanistisk forståelse av denne prosessen. Vi håper at tilsvarende identifikasjon av proteiner som binder seg til ATG8-proteinene ved membranskade, vil gi oss en bedre forståelse av ATG8 avhengige prosesser knyttet til membranskade.
Problemstilling
Hvilke proteiner er avhengige av ATG8 for å bli rekruttert til skadede intracellulære membraner? Videre, hvilke prosesser i cellen gir beskyttelse og blir fasilitert av disse ATG8-avhengige proteinene?
Mål og metode
Identifisering av ATG8-interaksjoner ved membranskade:
- Vi vil bruke proximity biotinylering-metoden for å kartlegge proteiner som befinner seg i umiddelbar nærhet av ATG8 ved membranskade og som krever ATG8 for å bli rekruttert til den skadde membranen. Vi har allerede utviklet flere cellelinjer med ulike varianter av proximity-biotinyleringsverktøyet og vil la studenten analysere hvilket verktøy som er optimalt for vårt formål.
Generering av prøver for massespektrometri-analyse:
- Når optimalt verktøy er valgt, vil vi gjennomføre et større forsøk i celler hvor vi ved hjelp av dette verktøyet vil innmerke proteiner som blir rekruttert til skadde membraner ved hjelp av ATG8. Deretter vil vi identifisere disse proteinene ved hjelp av massespektroskopi.
Karakterisering av ATG8-interaksjonspartnere:
- Etter identifisering av spesifikke interaksjonspartnere for ATG8-proteiner vil vi begynne å karakterisere dem. Vi vil først analysere disse proteinene grundig ut ifra funksjonene som allerede er kjent i litteraturen. De mest interessante kandidatene vil bli videre analysert ved hjelp av molekylærbiologiske metoder som inkluderer «knock out» ved CRISPR/Cas9, produksjon av transgene cellelinjer som uttrykker fusjonsproteiner eller muterte proteiner, mikroskopi, proteinrensing og proteininteraksjon analyse (ATG8 binding til kandidatproteiner). Studenten vil bruke disse verktøyene for å studere effektene på membranskade og reparasjon og vil bidra til å utvikle vår forståelse av rollen til ATG8 i disse prosessene.
Studentens arbeidsoppgaver
- Kloning av DNA konstrukter for molekylærbiologiske metoder
- Lage cellelinjer:
- CRISPR/Cas9 KO
- Introduksjon av modifisert DNA i celler ved bruk av lentivirus
- Utføre assay for membranskade og membranreperasjon
- Mikroskopi
- Proteinrensing og proteininteraksjons analyse
- SDS-PAGE og Western blot
Om forskningsmiljøet
Dette prosjektet vil bli gjennomført i Professor Harald Stenmarks forskningsgruppe i forskningsbygget på Radiumhospitalet (DNR), under ledelse av prosjektleder Alf Håkon Lystad. Lystads prosjektgruppe består av en Erasmus-student, en phd.d-stipendiat, en postdoktor og Lystad selv. Samtidig består hele forskningsgruppen til Professor Stenmark av over 40 forskere. På DNR har vi tilgang til toppmoderne fasiliteter, inkludert en stor og moderne mikroskopipark, samt kjernefasiliteter for cellesortering og massespektrometri. Vi er også en del av et center of excellence, sammen med fem andre forskningsgrupper og flere assosierte laber, som gir oss en ideell arena for samarbeid og diskusjon av resultater.
For tiden har vi også samarbeid med AstraZeneca, Yale og Universitetet i Umeå, som bidrar med spisskompetanse til dette prosjektet. Finansieringen for prosjektet kommer fra Norsk forskningsråd gjennom programmet "Young Research Talent", som også gir midler til en dedikert postdoktor i tillegg til Lystad som prosjektleder. Med denne solide strukturen på plass, har vi en ideell plattform for å gjennomføre prosjektet på en vellykket måte.