Mekaniske krefter som driver utviklingen av fettlever (IAFL) og leverkreft (HCC)

Bakgrunn

Ikke-alkoholisk fettlever (IAFL) er den mest utbredte leversykdommen i Vesten. IAFL er karakterisert med opphoping av fett i leveren som følge av et usunt kosthold og fører til inflammasjon og leverskade (non-alcoholic steatohepatitis, NASH), og til slutt kreft. I dag har over 35% av den norske befolkningen IAFL, og rundt 20% av personene med IAFL vil utvikle NASH.

Selv om sjansen for å utvikle IAFL øker med økt fedme, spiller også arv en viktig rolle for om en person utvikler IAFL. De to mest kjente genene som påvirker den arvelige komponenten til å utvikle IAFL heter PNPLA3 (Patatin-like phospholipase domain-containing 3) og TM6SF2 (Transmembrane 6 superfamily 2). Mutasjoner i disse to IAFL assosierte genene påvirker lagringen av fett i leverens lipiddråper, hvor både størrelse og lokalisering av intracellulære lipiddråper er affisert.

Cellekjernen integrerer biokjemiske og mekaniske signaler og oversetter disse til transkripsjonelle og andre cellulære responser som har direkte effekter på cellens funksjon og identitet. Når cellekjernen utsettes for mekanisk stress kan det føre til en midlertidig ruptur av kjernekonvolutten som medfører varig DNA skade, utskillelse av inflammatoriske cytokiner og re-modellering av den ekstracellulære matriksen. Våre preliminære data tyder på at forstørrede lipiddråper kan medføre endringer i kjerneform og ruptur i kjernemembranen til hepatocytter.

Vår hypotese for dette prosjektet er derfor at forstørrede og feillokaliserte lipiddråper medfører mekanisk stress på cellekjernene til hepatocytter. Mekanisk stress indusert av lipiddråper starter dermed en «ond sirkel» som fører til DNA skade, økt produksjon av inflammatoriske cytokiner, og mer fibrotisk ekstracellulær matriks som er annen mekanisk stressfaktor for cellekjernen.

Problemstilling

I dette prosjektet skal vi prøve å få svar på følgende spørsmål:

• Påfører forstørrede og feillokaliserte lipiddråper mekanisk stress på cellekjernene til hepatocytter, og er dette en viktig faktor i utviklingen av IAFL?
• Bidrar kjente IAFL mutasjoner i PNPLA3 og TM6SF2 til økt mekaniske stress på cellekjernene ved at de påvirker lokalisasjonen og størrelsen til hepatocyttenes lipiddråper?
• Forverrer stivheten av det ekstracellulære matriks (fibrose) dette fenomenet?

Mål og metode

For å klargjøre om store og feillokaliserte lipiddråper kan medføre mekaniske stress på cellekjernene til hepatocytter vil vi i første omgang dyrke humane hepatocytter (cellelinjen Huh7) i et medie som inneholder fettsyren oljesyre (400 μM) med og uten substrater av forskjellige stivheter (2kPa og 20kPa). For å studere effektene av PNPLA3 og TM6SF2 skal vi introdusere mutasjoner i disse genene som er koblet til utviklingen av IAFL. Vi vil ta bilder av hepatocyttene med både fiksert og live mikroskopi (eksempel i Figur 1) for å følge effektene av disse behandlingene. Vi vil også validere at vi har økt akkumulering av triglyserider i hepatocyttene ved hjelp av en kombinasjon av lipidekstraksjon og kolorimetriske metoder.  

For å undersøke hvordan kjernestress (oljesyre og stivhetsbehandlinger) påvirker hepatocyttenes cellekjerner vil vi studere mekanosensitive transkripsjonsfaktorer med mikroskopi, og ved å måle uttrykket av viktige gener (RT-qPCR) og proteiner (western blot) som er involvert i cellestress, identitet, og inflammasjon.

Studentens arbeidsoppgaver

• Dyrke og manipulere hepatocytter i kultur. Muligens vil vi også studere leverorganoider (iPSC-avledete)
• Modulere mekaniske stressorer ved å indusere lipiddråper (oljesyre) eller ved å endre stivhet av substratet (hydrogeler)
• Lage transgene hepatocyttcellelinjer ved å introdusere mutasjoner i PNPLA3 (PNPLA3I148M) og TM6SF2 (TM6SF2E167K) gjennom lentivirus og CRISPR
• Introduksjon av fluorescensmarkører for mekanisk stress gjennom lentiviral transduksjon for bruk i mikroskopi
• Følge utviklingen av mekanisk stress i hepatocytter gjennom avansert mikroskopi av levende (live-cell) og fikserte celle (immunofarging) celler
• Bruk standard molekylærbiologiske tekniker som siRNA behandling (for å hemme uttrykket av PNPLA3 og TM6SF2), RT-qPCR (uttrykk av målgener), western blot, og kloning (hvis nødvendig)

Om forskningsmiljøet

Dette prosjektet er et samarbeid mellom forskningsgruppene til Coen Campsteijn (Biokjemi, Molekylærmedisin) og Frode Norheim (Molekylær Ernæring). Disse forskningsmiljøer tilsammen tilsvarer 1 postdoktor, 4 stipendiater og 2 ingeniører – i tillegg til gruppelederne. Miljøet er veldig internasjonalt (fagspråket er engelsk), og bygger på samarbeidsprosjekter i Oslo og internasjonalt (Belgia, USA), og spesielt relevant her er samarbeidet med Gareth Sullivan sin gruppe (OUS) rundt iPSC-avledete leverorganoider. Komplementær ekspertise mellom veiledere betyr at studenten vil få opplæring og veiledning i et meget bredt spekter av cellebiologiske metoder og teknikker.